NC文章教你做高质量的肠道菌群队列研究 | 项目文章

肠道菌群在人类健康的维持，以及疾病的发生发展中的重要性已不言而喻。想要开展肠道菌群研究的老师非常多，大家经常问，我的设计合理吗，怎样的设计能出高水平的工作？虽然不同的课题会有不同的设计，但是确实会有一些共性的设计考量和做法。这次小编以复旦大学附属肿瘤医院马延磊教授课题组11月发表于Nature Communications的工作——Dysbiosis of human gut microbiome in young-onset colorectal cancer（早发性结直肠癌患者的肠道菌群特征）为例，看看他们是怎么来设计一项高质量的菌群队列研究的。
01研究背景结肠癌（CRC）是世界上第三大常见癌症，是一种传统的老年疾病。然而近年来CRC在年轻人中发病率正在稳步上升，而且通常表现出更严重且不良病理特征。目前缺乏用于早发性CRC（yCRC）诊断和治疗的方案。肠道菌群已成为人类不同年龄段CRC发病的关键环境因素。本课题希望通过对yCRC和晚发性CRC（oCRC）的肠道菌群特征研究，揭示不同年龄段CRC的发病机制，并鉴定出诊断yCRC的生物标志物。
02研究设计为达成上述研究目的，作者采用严格的招募程序，共纳入1038例符合条件的病例，分为2个队列Fudan（728例）和Huadong（310例），共有4个组，其中yCRC组为185例，oCRC组为379例，217例年龄匹配的yCRC健康对照组（yControl），257例oCRC的健康对照组（oControl）（图1）（yCRC组为年龄< 50岁；oCRC组为年龄≥ 50岁）。为筛选潜在的菌群标志物，将Fudan队列随机分为训练集（占70%）和测试集（占30%）。在训练集中，使用随机森林模型在CRC和年龄匹配对照之间进行菌群标志物鉴定（oCRC vs. oControl；yCRC vs. yControl）。在测试集中，验证菌群标志物区分oCRC或yCRC与健康对照的性能。进一步地，又使用Huadong队列进行独立的外部验证。同时，采用非定量粪便潜血试验（FOBT）、血清癌胚抗原（CEA）、血清糖类抗原19-9（CA19-9）与CRC菌群标志物进行性能比较。

图1 研究设计和流程图

注：作者最初共纳入1071例受试者，因诊断为非腺癌、遗失临床信息、数据产出不足等原因而剔除33例。

03研究方法

16S rRNA基因测序（1038例）

 宏基因组测序（200例，每组各50例）

04 研究发现

4.1 yCRC患者肠道菌群出现失调
首先通过alpha多样性评估yCRC和oCRC细菌多样性的差异。结果表明，相比于对照，oCRC组和yCRC组的粪便菌群的alpha多样性都显著降低。但是，相比于oCRC，yCRC的微生物多样性却显著增加（图2a，b）。此外，维恩图分析显示，四个组中有326个共享的菌属，yCRC组和oCRC组之间共享361个菌属，并且发现有12个菌属是yCRC组特有的（图2c）。Beta多样性（PCoA）分析结果显示，四个组的菌群分布有显著差异（图2d）。上述结果表明，不同于oCRC组，yCRC组具有独特的多样性和微生物分布。

图2 yCRC和oCRC粪便菌群的细菌多样性

4.2  yCRC粪便菌群的系统发育谱
为鉴定oCRC和yCRC中的差异丰度菌群，使用LEfSe算法对oCRC vs. oControl和yCRC vs. yControl的粪便菌群组成进行分析。结果发现oCRC和oControl之间有38个细菌类群具有显著的相对丰度差异，yCRC和yControl之间则有24个细菌类群存在差异（图3a，b）。在使用MaAsLin2校正年龄和性别后，前述差异菌属中仍分别有22个和8个是显著差异的（图3中#标注）。具体地，oCRC组中Streptococcus、Fusobacterium和Gemella的丰度增加，而Fusobacterium、Flavonifractor和Odoribacter是yCRC组中的关键菌。

图3 yCRC和oCRC粪便菌群的系统发育谱

鉴于肠道菌群失调与肿瘤分期和肿瘤部位有关，作者对oCRC和yCRC的不同疾病阶段的微生物组特征进行分类和比较。结果表明，肠道菌群与临床病理特征之间存在显著的相互作用。为深入洞察肠道菌群的物种组成和代谢归属，作者从Fudan队列中每组随机抽取50例样本，进行宏基因组测序分析（该技术具有种水平的菌群分辨率）。Procrustes和Mantel test确认了16S rRNA基因测序和宏基因组测序在菌群组成上具有强相关性。相比于16S rRNA基因测序，宏基因组测序支持Streptococcus属仍然是oCRC组中的关键菌，而Flavonifractor属是yCRC组中占主导的微生物。接着，基于宏基因组数据，使用LEfSe算法对oCRC vs. oControl和yCRC vs. yControl进行种水平的菌群标志物鉴定。相比于yControl，16S rRNA基因测序和宏基因组测序数据都显示，Flavonifractor plautii是yCRC中的优势菌群。相比于oControl，Enterocloster bolteae，Lachnospire eligens和Eggerthella lenta是oCRC中的关键菌。整体上，宏基因组数据和16S数据的相关性很好。

4.3 粪便菌群的功能分析
通过对宏基因组数据进行KEGG和GO富集分析，来研究粪便菌群的功能和代谢变化。结果显示，相比于CRC，参与短链脂肪酸新陈代谢的KEGG模块在健康人群中的比例较高。GO富集分析结果显示，质膜和蛋白结合是oCRC中富集的关键项，而DNA结合和RNA依赖的DNA生物合成过程是yCRC中占主导的项，这表明yCRC具有更强的细胞增殖和侵袭能力。综上所述，yCRC和oCRC患者都有其独特的细菌代谢特征。

4.4 yCRC和oCRC的粪菌标志物鉴定与验证
为评价粪便细菌标志物对oCRC和yCRC的鉴别能力，作者构建了随机森林分类器（RFC）模型。在yCRC vs oControl，oCRC vs oControl中，分别鉴定出60个和40个菌群标志物，它们在训练集中对应的AUC值为86.57%、89.28%，在测试集中对应的AUC值为79.52%、86.67%（图4,5）。此外，作者又选取Huadong队列（310例）作为独立的外部验证集，对应的AUC值分别为87.8%、86.67%（图6）。这些结果表明，粪便菌群标志物具有较强的区分yCRC或oCRC患者与健康人群的能力。

图4 用随机森林模型鉴定oCRC的菌群标志物

图5 用随机森林模型鉴定yCRC的菌群标志物

图6 独立外部验证yCRC和oCRC的菌群标志物

4.5 粪便菌群标志物对yCRC和oCRC的预测性能
为评价RFC菌群标志物的预测性能，作者将菌群标志物与常规筛查方法，包括非定量粪便潜血试验（FOBT）、血清癌胚抗原（CEA）、血清糖类抗原19-9（CA19-9）进行了预测性能的比较。结果显示在Fudan和Huadong两个队列中，不管是yCRC vs oControl，还是oCRC vs oControl，菌群标志物的AUC值均高于常规筛查方法的AUC值（图7）。总体来说，肠道菌群标志物是一种有巨大潜力的检测和区分yCRC和oCRC的无创工具。

图7 菌群标志物与常规筛查方法的预测性能比较

05 研究结论本研究揭示出yCRC和oCRC人群都会出现粪便菌群失调的状态，而相比于常规筛查方法，使用粪便菌群标志物鉴别yCRC和对照人群优势突出。

参考文献

Yang Y, et al. Dysbiosis of human gut microbiome in young-onset colorectal cancer. Nat Commun. 2021 Nov 19;12(1):6757.

编者小评

“同样是做菌群多样性分析的研究，为什么我的发文档次上不去？”

本项工作给出了很好地回答和示范。

首先，严谨的实验设计。作者是研究早发性CRC患者的肠道菌群特征，不仅设计有与yCRC年龄匹配的健康对照，也设计有晚发性CRC患者以及oCRC年龄匹配的对照。这样的设计才能更好地找出yCRC的肠道菌群（专属）的特征。在筛查菌群标志物时，不仅采用训练集和测试集的设计（来自Fudan队列），还引入外部验证集（来自Huadong队列），大幅提高了菌群标志物的可靠性和有效性；

其次，做大队列研究。这是由菌群的特征决定的，菌群组成在人群中的变化大，个体遗传和生理因素、健康状态、生活方式以及种族等都会引起菌群组成的变化。因此，开展微生物组研究时，样本数量的多少将直接决定结果的可信程度；

再次，菌群功能探讨。微生物组的研究，停留在多样性分析是远远不够的。只有揭示菌群所发挥的功能，才能进一步解释菌群失调与疾病发生发展的关系乃至作用机制。宏基因组测序是揭示菌群功能的首选方法。本项工作通过对200例样本的宏基因组测序，发现yCRC组有较强的细胞增殖和侵袭能力，表现出一种更倾向恶性进展的代谢状态，这可能部分解释了yCRC的预后较差；

最后，回到临床应用。通过yCRC患者的肠道菌群特征分析，进而鉴定出能区分yCRC和yControl的菌群标志物。借助与多种常规筛查方法的预测性能比较，进一步证明菌群标志物是更优的区分yCRC和yControl的工具，这将有利于临床上对yCRC的早筛，以及更早地干预或治疗。

还能加些什么组学数据。优先考虑代谢组。研究肠道菌群对宿主的作用，常常会带着菌群的代谢组和（或）体内循环代谢组一起做联合分析和讨论，可以更深入地揭示菌群与宿主的相互作用。

希望以上的建议，对读者能有所启发。

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